Kit PCR en temps réel du virus Monkeypox

1. ÉchantillonCollection:L'échantillon doit être collecté dans des tubes stériles conformément

avec des spécifications techniques standards.

2. Préparation des réactifs (zone de préparation des réactifs)

Sortez les composants du kit, équilibrez-les à température ambiante pour une utilisation en veille.

3. Traitement des échantillons (zone de traitement des échantillons)

3.1 Extraction d'acide nucléique

Il est recommandé de prélever des échantillons liquides de 200 μL, un contrôle positif et un contrôle négatif pour l'extraction de l'acide nucléique, conformément aux exigences et procédures correspondantes des kits d'extraction d'ADN viral.

3.2 Dissolution de poudre lyophilisée et ajout de modèle

Préparer le prémélange lyophilisé du virus Monkeypox en fonction du nombre d’échantillons.Un échantillon nécessite un tube PCR contenant de la poudre de prémélange lyophilisée.Le contrôle négatif et le contrôle positif doivent être traités comme deux échantillons.

(1) Ajoutez 15 μL de solution dissolvante dans chaque tube PCR contenant un prémélange lyophilisé, puis ajoutez 5 μL d'échantillons extraits/contrôle négatif/contrôle positif dans chaque tube PCR respectivement.

(2) Couvrez hermétiquement les tubes PCR, feuilletez les tubes PCR à la main jusqu'à ce que la poudre lyophilisée soit complètement dissoute et mélangée, récupérez le liquide au fond des tubes PCR par centrifugation instantanée à basse vitesse.

(3) Si vous utilisez un instrument PCR en temps réel commun pour la détection, transférez directement les tubes PCR vers la zone d'amplification ;Si vous utilisez BTK-8 pour la détection, vous devez alors effectuer les opérations suivantes : transférer 10 μL de liquide du tube PCR vers le puits de la puce de réaction du BTK-8.Un tube PCR correspond à un puits sur la puce.Pendant l’opération de pipetage, assurez-vous que la pipette est à 90 degrés verticalement.Les pointes de pipette avec barrière contre les aérosols doivent être placées au centre du puits avec une force modérée et arrêter de pousser la pipette lorsqu'elle atteint la première vitesse (pour éviter les bulles).Une fois les puits remplis, retirez une membrane de puce de réaction pour couvrir tous les puits et la puce est ensuite transférée vers la zone de détection d'amplification.

4. Amplification PCR (zone de détection)

4.1 Placez les tubes PCR/puce de réaction dans le réservoir de réaction et définissez les noms de chaque puits de réaction dans l'ordre correspondant.

4.2 Paramètres de fluorescence de détection : (1) Virus Monkeypox (FAM) ;(2) Contrôle Interne (CY5).

4.3 Exécutez le protocole de cyclisme suivant

Protocole d'ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio :

 Protocole de BTK-8 :

5. Analyse des résultats (veuillez vous référer au manuel d'utilisation de l'instrument)

Après la réaction, les résultats seront automatiquement enregistrés.Cliquez sur « Analyser » pour analyser et l'instrument interprétera automatiquement les valeurs Ct de chaque échantillon dans la colonne de résultats.Les résultats des contrôles négatifs et positifs doivent être conformes au « 6. Contrôle qualité » suivant.

6. Contrôle de qualité

6.1 Contrôle négatif : Pas de Ct ou Ct>40 dans le canal FAM, Ct≤40 dans le canal CY5 avec courbe d'amplification normale.

6.2 Contrôle positif : Ct≤35 dans le canal FAM avec courbe d'amplification normale, Ct≤40 dans le canal CY5 avec courbe d'amplification normale.

6.3 Le résultat est valide si tous les critères ci-dessus sont remplis.Sinon, le résultat n'est pas valide.

Interprétation des résultats

Les résultats suivants sont possibles :

NOTE: Si un résultat invalide apparaît, l'échantillon doit être collecté et testé à nouveau.